Produzione di β-nicotinamide mononucleotide (NMN) in Escherichia coli

Astratto

Il diabete è una malattia cronica e progressiva con una prevalenza in costante aumento, una crescente pressione finanziaria sui sistemi sanitari mondiali. Recentemente, l'insulino-resistenza, segno distintivo del diabete di tipo 2, è stata curata nei topi trattati con precursore NAD ⁺ β-nicotinamide mononucleotide (NMN) , senza effetti tossici. Tuttavia, NMN ha un prezzo elevato, sono necessari metodi di produzione più convenienti. Questo studio propone un metodo di produzione biotecnologico di NMN in Escherichia coli . Mostriamo che l'espressione bicistronica di nicotinamide fosforibosil transferasi ricombinante (Nampt) e fosforibosil pirofosfato (PRPP) sintetasi in presenza di nicotinamide (NAM) e lattosio può essere una strategia di successo per una produzione NMN economica. I vettori di espressione proteica che trasportavano il gene NAMPT da Haemophilus ducreyi e PRPP sintetasi da Bacillus amyloliquefaciens con mutazione L135I sono stati trasformati in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. La produzione di NMN ha raggiunto un massimo di 15,42 mg per L di coltura batterica (o 17,26 mg per grammo di proteine) in queste cellule coltivate in terreno PYA8 integrato con 0,1% NAM e 1% lattosio.

introduzione

Secondo l'International Diabetes Federation, il numero di adulti con diabete di tipo 2 era di 425 milioni nel 2017 e si prevede che raggiungerà i 649 milioni entro il 2045. Su scala globale, viene speso il 12% del budget sanitario (o 727 miliardi di dollari) sulla cura del diabete. Studi recenti hanno collegato l'insulino-resistenza, il segno distintivo del diabete di tipo 2, al declino della funzione mitocondriale e alla riduzione dei livelli di NAD ⁺ e del rapporto NAD ⁺ / NADH, osservati anche durante l'invecchiamento. NAD ⁺ è presente in tutti gli organismi viventi ed è un noto coenzima nelle reazioni di riduzione dell'ossidazione. Deacetilasi proteiche dipendenti dalla NAD ⁺ come SIRT1 e SIRT6 fungono da sensori metabolici e regolano le vie a valle, che alla fine ripristinano la funzione mitocondriale e la sensibilità all'insulina. Questa scoperta estende il campo di ricerca degli effetti NAD ⁺ ad altre malattie degenerative associate all'invecchiamento, come: cardiovascolare, cancro, artrite, osteoporosi o malattie di Alzheimer.

Il mononucleotide β-nicotinamide (NMN) è un intermedio della biosintesi NAD ⁺ prodotta da nicotinamide (NAM) e fosforibosil pirofosfato (PRPP) dall'enzima nicotinamide fosforibosil transferasi (Nampt) (EC 2.4.2.12). Essendo ben tollerato, senza effetti collaterali segnalati durante la somministrazione a lungo termine nei topi e prevenendo il declino fisiologico associato all'età, la NMN si è dimostrata efficace nel trattamento del diabete di tipo 2 indotto da dieta ricca di grassi, invertendo la disfunzione mitocondriale associata all'invecchiamento e salvando l'effetto del declino associato all'età delle cellule staminali neurali.

Il NAM viene solitamente convertito in NMN dagli enzimi coinvolti nelle vie di salvataggio NAD ⁺ , come Nampt. L'azione di questo enzima costituisce la principale attività anabolica NAD ⁺ nella cellula. La regolazione del metabolismo e della biosintesi dei mammiferi o dei microrganismi di solito procede per consumo di PRPP. Il PRPP deriva dal ribosio-5-fosfato attraverso i rami ossidativo e non ossidativo della via del pentoso fosfato.

Nei batteri, la NAM viene spesso convertita in acido nicotinico (NA) dalla nicotinamidasi, che è integrata nel percorso Preiss-Handler, questo è anche il caso dell'Escherichia col . Nei mammiferi non è stata segnalata l'attività della nicotinamidasi; NAM viene invece convertito in NMN da uno degli enzimi fosforibosil transferasi NAM. Sebbene la maggior parte dei batteri sia priva di fosforibosil transferasi NAM, l'enzima è espresso in Haemophilus ducreyi e Shewanella oneidensis .

Organismi semplici e metabolicamente versatili, come l' Escherichia coli , sono spesso utilizzati in biotecnologia per l'espressione controllata delle proteine con l'attività enzimatica desiderata. La codifica del DNA per tali enzimi viene spesso introdotta nei batteri da vettori di espressione come il sistema pET di Novagen. I vettori pET vengono trasformati in batteri che esprimono T7 RNA polimerasi, come E. coli BL21 (DE3). Il controllo dell'espressione degli enzimi viene ottenuto utilizzando il promotore lac , che attiva l'espressione solo in presenza di lattosio (anche metabolizzato come fonte di carbonio) o del suo analogo strutturale sintetico, Isopropyl-1-Thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) ( non metabolizzato, con concentrazione costante durante il processo di crescita). Poiché il metabolismo batterico è versatile, la variazione della fonte di carbonio e la concentrazione di substrati enzimatici a media integrazione sono fattori chiave da prendere in considerazione in un processo biotecnologico.

Con l'obiettivo di affrontare l'attuale problema dei prezzi elevati della NMN , nel nostro precedente lavoro abbiamo proposto un metodo di purificazione dalle cellule batteriche. Per un'ulteriore ottimizzazione del processo, poiché siamo riusciti a trovare solo un metodo di produzione di lievito pubblicato, questo studio propone un metodo di produzione biotecnologica NMN semplice ed economico in Escherichia coli .

risultati

Trasformazione batterica

L'allineamento di sequenze di aminoacidi multipli generato per il putativo NadV da Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 e Nampt da Mus musculus , mostra un'elevata somiglianza (Fig. S1), rendendo tutti questi enzimi candidati per un processo biotecnologico.

E trasformato. cellule coli con geni nadV (NAMPT) trasportate da plasmidi pET28a (+) formavano colonie sulle piastre di LB Agar integrate con kanamicina. Non sono state rilevate colonie su piastre inoculate con cellule batteriche non trasformate. L'elettroforesi su gel di agarosio del DNA plasmidico isolata da queste colonie ha confermato la presenza di plasmidi Nampt-PET28a, pET28a-soNadV o pET28a-hdNadV in E. coli DH5α (Figura complementare S2A, corsia 2, 3, 4). Le bande di DNA corrispondevano alle bande di E. Celle BL21 (DE3) pLysS (Figura complementare S2A, corsia 6, 7, 8), che sono state trasformate con corrispondenti plasmidi estratti direttamente da E. coli DH5α. In E non trasformato. Celle BL21 (DE3) coli BL21 (DE3), usate come controllo negativo, la presenza del plasmide pLysS è stata confermata mediante elettroforesi, una banda corrispondente alla lunghezza nota di 4886 bp (Figura supplementare S2A, corsia 5) è stata mostrata sul gel di agarosio.

(Per ulteriori dati sperimentali, consultare il sito Web originale: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)